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本制品是一种使用新型核酸纯化介质包被的磁珠，用于稳定、高效、便捷地分离血清和血浆样品中游离于细胞外的DNA(cfDNA)的试剂盒。提取得到的游离DNA可直接用于PCR、qPCR、NGS、DNA甲基化定量检测等实验。

本试剂盒适用于新鲜或冻存的血清或血浆游离DNA的提取，最低适用于20μL血清/血浆样品的提取。样品可为新鲜制备或冻存的血清或血浆，对于-80℃保存的样品须避免多次反复冻融。

游离于细胞外的DNA (Cell-free DNA)，简称游离DNA，又称游离循环DNA (Circulating cell-free DNA)，是指循环血液中游离于细胞外的DNA，是机体内源性降解产生的DNA。Cell-free DNA片段通常小于1000bp，浓度个体差别较大，通常在1～100ng/mL，Cell-free DNA被发现与某些疾病如癌症等关系密切，对疾病的早期诊断、预后、检测具有重要价值。

• 本试剂盒具有提取效果稳定、纯度高、操作灵活便捷等优点。本试剂盒的游离DNA提取体系经过反复测试和优化，能回收低至1ng/mL DNA片段。样品裂解仅需10分钟，裂解完成后提取的时间仅约25～30分钟，比很多同类产品具有明显的优势。
  
• 本试剂盒使用安全和便捷。目前游离DNA提取的方法主要为酚氯仿法、柱纯化法和磁珠法。传统的酚氯仿法不仅涉及有毒有刺激的有机溶剂，而且提取时间长、操作繁琐。柱纯化法通常需要反复离心，或者需要特殊的抽滤装置。而磁珠法条件温和，整个操作步骤无需繁琐的反复离心或抽滤操作，而以简单的磁铁吸附代替，确保了操作的快速和便捷。

组分	50T	200T
BalbMag磁珠	1mL	4mL
裂解液	10mL	40mL
洗涤液I	21mL	81mL
洗涤液II	16mL	60mL
洗脱液	5mL	20mL
蛋白酶K	0.5mL	2mL

保存：室温，其中蛋白酶K需置于-20℃，有效期1年。

• BalbMag磁珠长期不使用时，可以4℃保存，4℃可以保存更长时间。蛋白酶K在室温(15～25℃)存放一周，活
  
• 第一次使用前洗涤液I和洗涤液II需添加指定量的无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。
  
  • 按洗涤液I∶无水乙醇＝2∶1的比例加入无水乙醇，即21mL和81mL洗涤液I分别加入7mL和27mL无水乙醇。
    
  • 按洗涤液II∶无水乙醇＝2∶3的比例加入无水乙醇，即16mL和60mL洗涤液II分别加入24mL和90mL无水乙醇。
• 需自备无水乙醇和磁分离装置。
  
• 温度较低时样品裂解液中可能会有沉淀产生，属正常现象。使用前必须检查一遍。如有沉淀，55℃水浴孵育使沉淀溶解，混匀后使用。
  
• 磁珠在静置后会发生沉降，使用前一定要适当涡旋震荡或颠倒数次至充分混匀。
  
• 磁分离前应适度震荡离心管使磁珠充分分散后再靠近磁场。如果出现磁珠挂壁现象，可以在磁珠聚集后晃动管内液体，使挂壁的磁珠流下。
  
• 本制品适用于手工提取，也可用于工作站或核酸自动提取仪。
  
• 裂解液对人体都有刺激性，操作时请小心，并注意适当防护。

本试剂盒的原理和主要操作过程如图1所示。血清或血浆样品在裂解液和蛋白酶K的作用下迅速裂解，释放出来的Cell-free DNA在特定条件下与磁珠特异性结合，在外界磁场(如磁分离架)的作用下，磁珠与相应溶液可以快速而高效地分离，再经洗涤充分去除杂质，最后用洗脱液将Cell-free DNA从磁珠上洗脱下来。

图1．磁珠法游离DNA提取试剂盒提取原理示意图。


本试剂盒回收170bp的DNA片段和提取冻存小鼠血清的游离DNA的效果参考图2。

图2．磁珠法游离DNA提取试剂盒用于从胎牛血清中回收170bp DNA片段和小鼠血清中提取游离DNA的效果图。图A为将170bp的DNA加入到胎牛血清中，浓度分别为1ng/mL、10ng/mL和100ng/mL，然后使用本试剂盒提取游离DNA，并使用荧光定量PCR反应预混液(SYBR Green I)进行qPCR定量检测回收效率。图B为本试剂盒及国外同类竞品提取小鼠血清游离DNA的效果，然后使用荧光定量PCR反应预混液和三组内参引物(Actin、B2M和GAPDH)进行qPCR检测，图中可见使用本试剂盒及国外同类竞品提取的游离DNA，qPCR检测的Ct值基本一致。实际结果会因实验条件、检测仪器等的不同而存在差异，图中数据仅供参考。

• 取血清或血浆样品20～200μL，加入200μL裂解液，10μL蛋白酶K，Vortex混匀或震荡，56℃孵育裂解10分钟。
  
• 冷却至室温，每管加入200μL无水乙醇，再加入20μL BalbMag磁珠悬液(使用前务必混匀)，轻柔混匀后，室温放置5分钟，其间轻柔颠倒1～2次。将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸除残液。
  
  • 加入乙醇后可能会有白色絮状物出现，此为正常现象。
  • 磁珠在使用前一定要涡旋或震荡混匀。如有必要，可适当增加磁珠用量，延长结合时间以提高得率。
• 加入500μL洗涤液I（请确保已加入无水乙醇），轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。
  
  • 如果离心管内盖有磁珠，可按住离心管整体上下颠倒2次，使磁珠被完全吸附，然后弃去上清。
• 加入600μL洗涤液II（请确保已加入无水乙醇），轻柔震荡使磁珠分散开，颠倒2次后将离心管置于磁力架的磁场中，待磁珠完全聚集后，尽量吸净残液。
  
• 将离心管室温放置5～10分钟，或置于37℃鼓风烘箱5分钟，确保残留的乙醇等微量液体完全挥发。
  
• 加入35～50μL洗脱液，轻柔震荡使磁珠悬于溶液中，室温孵育3～5分钟，其间甩动离心管1～2次。将离心管置于磁场中，待磁珠完全聚集后，小心吸取溶液至新离心管中，置于-20℃保存。所得溶液即为高纯度游离DNA。
  
  • 如需获得更高浓度的样品，可把洗脱液的体积减小至20μL，但洗脱下来的DNA量会相对减少。室温较低时，洗脱液在37℃预热片刻对得率有所帮助。此外，洗脱后的溶液再次加回到原磁珠再洗脱一次，可提高得率约10～30%；或者在第一次洗脱后使用新的洗脱液再洗脱一次，会获得约为第一次洗脱量15～40%的DNA。

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